14.ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ

Ферментами називаються колоїдні органічні з'єднання білкової природи, що синтезуються в клітинах живих організмів, та прискорюють і координують біохімічні реакції, які регулюють обмін речовин (метаболізм).

Залежно від хімічного складу ферменти прийнято поділяти на прості та складні. Прості ферменти – це прості білки, побудовані лише із залишків амінокислот. Складні – білки, молекула яких має небілкову частину, яка називається простетичнию групою. До простетичної групи часто входять вітаміни та метали: залізо, купрум, кобальт, манган, цинк, тощо.

Фізичні та хімічні властивості ферментів обумовлені їх білковою природою. Вони термолабільни, що не діалізують крізь напівпроникні мембрани, здатні до висолювання і дають характерні для білка якісні реакції. Ферменти є біологічними каталізаторами, та відрізняються від неорганічних каталізаторів вищою ефективністю і високою специфічністю по відношенню до своїх субстратів.

Ферменти є лабільними речовинами. За несприятливих умов вони легко денатурують та інактивуються. Працюючи з ферментами, слід, перш за все, не допустити їх інактивації. Слід уникати дії температури, яка перевищує 35…40 °С, а також кислих та лужних розчинів. Етиловий спирт, ацетон та інші органічні розчинники інактивують більшість ферментів за кімнатної температури. В багатьох випадках спостерігається повільна інактивація ферментів, як що залишити розчини на тривалий час навіть за сприятливих умов. Висушування за кімнатної температури супроводжується повною інактивацією ферментів, але активність їх зберігається, при висушуванні в умовах високого вакууму, або за низьких температур (в замороженому стані).

Каталітична активність ферментів характеризується кількістю субстрату, що прореагував, або кількістю продукту реакції за визначений час у присутності відомої вагової кількості ферменту. Вона може бути виражена у різних одиницях. Найчастіше каталітична активність ферментів виражається числом мікромолей субстрату, що прореагував за 1 хв. на визначену кількість ферменту або дослідженої речовини.

14.1 Визначення активності пероксидази

Пероксидаза відіграє важливу роль у процесі дихання рослин. Найбільш поширеними субстратами, на які діє пероксидаза в тканинах рослин, є поліфеноли у вільному стані або у формі різноманітних з'єднань (глікозиди, дубильні речовини) і ароматичні аміни. Окислення тих чи інших сполук пероксидаза здійснює за допомогою гідроген пероксиду або будь-яких органічних пероксидів, у тому ж разі пероксиду ненасичених жирних кислот і каротину.

14.1.1Визначення активності пероксидази методом титрування нерозкладеного гідроген пероксиду натрій тіосульфатом (за А. А. Землянухіним)

Суть методу

Грунтується на врахуванні нерозкладеного гідроген пероксиду при використанні в якості субстрату окислення пірокатехіну, який перетворються в відповідний о-бензохінон:

Пирокатехин.JPG

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: терези лабораторні аналітичні, термостат, центрифуга, порцелянова ступка з товкачиком, колби конічні на 100 см3, товчене скло або кварцевий пісок, бюретки, піпетки на 1, 2, 5, 10 см3.

Реактиви:

- фосфатний буфер 0,1 М рН 5,6; 1 % - вий розчин крохмалю;

- розчин пірокатехіна, 1 М: 11 г пірокатехіна розчинити у 100 см3 дистильованої води;

- розчин Н202, 0,01 н: готують спочатку 0,1 н розчин гідроген пероксиду: 30%-вий розчин Н202 розбавляють дистильованою водою до 500 см3. Або 0,17 г Н202 розчинити в 50 см3 дистильованої води; розчин зберігають в темній склянці в прохолодному місці не більше тижня; 0,01 н розчин готують розведенням в день проведення визначень.

- розчин сульфатної кислоти Н2SО4, 20% -вий: до 50 см3 води додають 65 см3 96 % - вої сульфатної кислоти;

- розчин натрій тіосульфату, 0,01 Н : 2,48 г натрій тіосульфату розчиняють у 1000 см3 дистильованої води;

- розчин калій йодиду, 30% - вий: 30 г соли и 70 воды.

Підготовка до проведення вимірювань:

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1.

- Проби, які надходять у лабораторію повинні бути без пошкоджень і змін якості продукту при транспортуванні та зберіганні;

Хід аналізу:

1.Отримання ферментної витяжки:

- 1 г рослинного матеріалу розтирають у ступці з кварцевим піском або товченим склом і 5 см3 фосфатного буфера рН 5,6;

- розтерту масу переносять у центрифужні пробірки та центрифугують 5 хв. за 4000 об / хв.;

- відбирають супернатант та заміряють його об'єм;

2. Приготування дослідного розчину для титрування:

- в колбу для титрування на 100 см3 вносять у строго визначеному порядку:

- 10 см3 0,01 н розчину Н202;

- 5 см3 фосфатного буфера рН 5,6;

- 2 см3 1 М розчину пірокатехіна;

- 1 см3 ферментної витяжки.

- колбу ставлять у термостат при 25 ° С та витримують 5 хв.;

- потім зупиняють реакцію додаванням 5 см3 20 % - вого розчину сульфатної кислоти Н2SО4;

3.Приготування контрольного розчину для титрування:

- в колбу для титрування на 100 см3 вносять у строго визначеному порядку:

- 10 см3 0,01 н розчину Н202;

- 5 см3 фосфатного буфера рН 5,6;

- 2 см3 1 М розчину пірокатехіна;

- 5 см3 20% -вого розчину Н2SО4;

- 1 см3 ферментної витяжки.

4.Проведення титрування:

- в обидві колби додають 5 см3 30 % - вого розчину КJ;

- додають 1…2 краплі крохмалю;

- відтитровують йод, який виділився 0,01 н розчином натрій тіосульфату до знебарвлення.

Розрахунки:

Активність фермента (Х) розраховують у мкмолях Н2О2 які розклалися за 1 хв. на 1 г наважки, з урахуванням того, що 1 см3 точно 0,01 н розчину Na2S2O3 відповідає 20 мкмолям Н2О2:

14.1.JPG

де A1 – кількість розчину натрій тіосульфату, яка витрачена на титрування контролю, см3;

A2 - кількість розчину натрій тіосульфату, яка витрачена на титрування досліду, см3;

V – загальний об'єм ферментної витяжки (супернатанту), см3;

V1 – об'єм витяжки, взятої для визначення, см3;

n – масса наважки, г,

t – час, хв.

За остаточний результат випробувань беруть середнє арифметичне значення двох паралельних вимірювань, підрахованих до четвертого десяткового знака.

14.1.2 Спектрофотометричні методи визначення активності пероксидази

14.1.2.1 Спектрофотометричний метод визначення активності пероксидази з використанням індигокарміну

Суть методу

Грунтується на зміні оптичної густини продуктів реакції, які утворилися внаслідок окислення індигокарміну за певний проміжок часу.

Реактиви:

- ацетатный буфер рН=4,9: до 3,5 об'єму 0,2 М оцтової кислоти додати 6,5 об'ємів 0,2 М натрій ацетату;

- 0,2 М оцтова кислота готується розведенням 11,2 см3 чистої кислоти у дистильованій воді до 1000 см3.

- 0,2 М розчин натрій ацетату готується розведенням 16,4 г безводного натрій ацетату або 27,2 г трьохводного кристалогідрату або 38 г шостиводного кристалогідрату в 1000 см3 води;

- 0,0005 М розчин індигокарміну: 0,0233 г речовини довести до 100 см3 дистильованою водою; зберігати в темній склянці;

- 20 % - вий розчин сульфатної кислоти: до 50 см3 дистильованої води додати 65 см3 96% -ної кислоти.

- 0,03 М розчин гідроген пероксиду: 1,5 г Н2О2 довести до 100 см3 Н2О – отримаємо 0,44 М розчин. В день проведення вимірювань до 1 см3 0,44 М розчину додати 14 см3 дистильованої води – отримаємо 0,03 М розчин.

Підготовка до проведення вимірювань:

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1.

Хід аналізу

- 1 г рослинного матеріалу розтирають у ступці з кварцевим піском або толченим склом;

- в дві центрифужні пробірки додають по:

- 1 см3 ацетатного буферу;

- 1 см3 індигокарміну;

- 0,5 см3 гомогенату;

- пробірки збовтати та центрифугувати 15 хв. за 3000 об.;

- у контрольну кювету додати:

- 1 см3 центрифугата,

- 0,5 см3 дистильованої води;

- 3 см3 сульфатної кислоти;

- у дослідну кювету додати:

- 1 см3 центрифугата;

- 0,5 см3 розчину гідроген пероксиду;

- включити секундомір;

- через 2 хв. додати 3 см3 розчину сульфатної кислоти.

- у контрольних і дослідних пробах визначають оптичну густину в кюветі з робочою довжиною 10 мм за довжини хвилі 590 нм проти дистильованої води.

Розрахунки:

Активність пероксидази А визначають у відносних одиницях на 1 г сирої маси (або на одиницю білка) за формулою:

14.2.JPG

де D1 – оптична густина контрольного;

D2 – оптична густина дослідного розчину;

t – час інкубації, сек., (120 сек.);

m - масса наважки, г;

V- загальний початковий об'єм витяжки, см3;

V1 - об'єм, взятый для проведения реакції, см3;

V2 - загальний обєм рідини в кюветі, см3;

60 – коефіцієнт переведення в хвилини.

За остаточний результат випробувань беруть середнє арифметичне значення трьох паралельних вимірювань, підрахованих до четвертого десяткового знака.

14.1.2.2 Спектрофотометричний метод визначення активності пероксидази з використанням гваякола

Суть методу

Грунтується на зміні оптичної густини продуктів реакції, які утворилися внаслідок окислення гваякола за певний проміжок часу.

Реактиви:

- 0,15 М фосфатний буфер рН 5,4;

- 0,15 % -й розчин гідроген пероксиду;

- розчин гваякола: 183 мг гваякола розчинити у 25 см3 дистильованої води, виготовляють в день проведення досліджень.

Підготовка до проведення вимірювань:

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1.

Хід аналізу:

- наважку рослинного матеріалу 200…500 мг розтирають у порцеляновій ступці з 5 см3 фосфатного буфера;

- переносять у мірну колбу на 25 см3,

- доводять буфером до позначки і настоюють;

- через 10 хв. настоювання екстракт центрифугують при 4000…6000 об./хв. протягом 10 хв.;

- у дослідну кювету спектрофотометра з робочою довжиною 10 мм вносять:

- 0,5 см3 субстрату,

- 1,5 см3 буферного розчину,

- 0,5 см3 ферментної витяжки (центрифугата),

- 0,5 см3 розчину гідроген пероксиду,

- з внесенням першої краплі гідроген пероксиду включають секундомір;

- перший вимір проводять через 20 с. Відлік знімають кілька разів через 20 с протягом 1…2 хв. або іншого інтервалу часу;

- попередньо встановлюють у нульовому положенні стрілку амперметра приладу по контрольній кюветі, в яку вносять компоненти реакційної суміші, але замість гідроген пероксиду додають таку ж кількість води (0,5 см3);

- оптичну густину розчинів вимірюють при 470 нм.

Розрахунки:

Активність пероксидази А визначають у відносних одиницях на 1 г сирої маси (або на одиницю білка) за формулою:

14.3.JPG

де D1 – оптична густина контрольного;

D2 – оптична густина дослідного розчину;

t1i t2 – час початку і кінця досліду, сек.;

m - масса наважки, г;

V- загальний початковий об'єм витяжки, см3;

V1 - об'єм, взятый для проведения реакції, см3;

V2 - загальний обєм рідини в кюветі, см3;

60 – коефіцієнт переведення в хвилини.

14.1.2.3Колориметричний метод визначення активності пероксидази (за А. М. Бояркіним)

Суть методу

Грунтується на визначенні швидкості реакції окислення бензидину до утворення синього продукту окислення певної концентрації, яка заздалегідь встановлюється на фотоелектроколориметрі.

Реактиви:

ацетатний буфер, 0,1 М розчин, рН 5,4; гідроген пероксиду, 0,3 % -вий розчин, розчин бензидину на ацетатному буфері: у мірну колбу на 200 см3 наливають 100 см3 дистильованої води, додають 2,3 см3 льодяної оцтової кислоти та 184 мг бензидину; колбу нагрівають на водяній бані за температури 60 °С, при постійному перемішуванні; після повного розчинення бензидину в колбу додають 5,45 г натрій ацетату, охолоджують та доводять водою до позначки.

Підготовка до проведення вимірювань:

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1.

Хід аналізу:

- наважку рослинного матеріалу масою 200…500 мг тонко розтирають у порцеляновій ступці з водою або ацетатним буфером з рН 5,4;

- переносять у мірну колбу на 50 см3;

- після 10 хв. настоювання витяжку центрифугують за 4000 об./хв. (для вимірювання активності краще брати таке розведення витяжки, щоб зміна забарвлення відбувалась за 20…60 с);

- у кварцову кювету з робочою довжиною 20 мм доливають 2 см3 ферментної витяжки або центрифугата, 2 см3 буферного розчину і 2 см3 бензидину;

- ставлять кювету в кюветотримач і встановлюють стрілку приладу на нульову позначку,

- потім додають 2 см3 розчину гідроген пероксиду піпеткою з широким носиком (щоб сильним струменем перемішати рідину в кюветі),

- одночасно з додаванням пероксиду вмикають секундомір;

- розчин у кюветі починає набувати синього кольору і по мірі наростання інтенсивності забарвлення стрілка приладу відхиляється;

- відзначають час від початку приливання розчину гідроген пероксиду до досягнення стрілкою приладу позначки 0,250.

- повторюють визначення тричі і беруть середнє значення часу.

Розрахунки:

Активність ферменту визначають за формулою:

14.4.JPG

де D – оптична густина, яка дорівнює 0,250;

а – відношення кількості рідини, взятої для приготування витяжки до маси сирої тканини, см3/г;

б – ступінь додаткового розведення витяжки після центрифугування;

в – ступінь постійного розведення витяжки в реакційній суміші в кюветі;

с – товщина шару (2 см);

t - час, с.

14.2 Визначення активності поліфенолоксидази за Х. Н. Починком

Поліфенолоксидаза, або о-дифенолоксидаза, відноситься до ферментів, що містять мідь. Вона, так само як і пероксидаза, відіграє важливу роль у процесі дихання рослин, каталізуючи реакцію окислення поліфенолів.

Суть методу

Полягає у тому, що досліджувану речовину у вигляді водної суспензії при рН близькому до 6, у присутності аскорбінової кислоти і пірокатехіну струшують протягом 2 хв. при температурі 20°С. При цьому відбувається окислення аскорбінової кислоти. Точно через 2 хв. реакція зупиняється додаванням метафосфорної кислоти і залишок аскорбінової кислоти визначають титруванням калій йодатом. З отриманих даних знаходять кількість окисленої аскорбінової кислоти і обчислюють активність ферменту (у мкмоль окисленої за 1 хв. аскорбінової кислоти на 1 г досліджуваної речовини).

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: терези лабораторні аналітичні, порцелянова ступка з товкачиком, колби конічні на 250 см3, колби мірні на 50 см3, склянки хімічні, бюретки, піпетки на 1, 2, 5, 10 см3, секундомір.

Реактиви:

- розчин пірокатехіна (0,2 % - вий): 0,2 г пірокатехіна розчиняють у дистильованій воді і доводять водою до 100 см3. Розчин готується на 1…2 доби та зберігається у темній склянці у прохолодному місті.

- розчин калій йодату (0,01 н): 0,3566 г KJO3 розчиняють у дистильованій воді в мірній колбі на 1000 см3, додають 5 см3 1н розчину NaOH і 2 г KJ; все розчиняють, розбавляють дистильованою водою до позначки, перемішують, зберігають у темній склянці.

- буферний розчин (рН 6,4): 5,44 г солі KH2PO4 розчиняють у дистильованій воді, додають 10 см3 1 н розчину NaOH, розбавляють водою до 200 см3 і зберігають у добре зачиненій склянці.

- розчин аскорбінової кислоти (0,04 н): 0,35 г аскорбінової кислоти розчиняють у дистильованій воді та доводять водою до 100 см3 і перемішують; розчин готують на 1 день.

- розчин метафосфорної кислоти (5 % - вий): 50 г HPO3 розчиняють у дистильованій воді, розбавляють до 1000 см3, перемішують і зберігають у склянці з притертою кришкою.

14.5.JPG

де А- активність поліфенолоксидази, в мкмоль окисленої за 1 хв. при 20°С аскорбинової кислоти на 1 г досліджуваної речовини;

50- загальний об'єм суспензії досліджуваної речовини, в см3;

n – наважка досліджуваної речовини, г,

10 – об'єм суспензії, використаний для визначення активності поліфенолоксидази, см3;

2 – час проведення реакції, хв.;

а – об'єм 0,01 н розчину калій йодату, витраченого на титрування контрольной проби, см3;

b - об'єм 0,01 н розчину калій йодату, витраченого на титрування досліджуваної проби, см3;

5 – коефіціент для перерахунку милілітров 0,01 н розчину аскорбінової кислоти в мікромолі.

14.3 Визначення активності аскорбатоксидази за Х. Н. Починком

Фермент аскорбатоксидаза відноситься до протеїнів, які містять мідь. Зустрічається в значних кількостях у гарбузі, кабачках, салаті, квасолі і ряді інших рослин. Найбільша активність ферменту проявляється при рН 6,0.

Аскорбатоксидаза – це оксидоредуктаза, яка каталізує окислення аскорбінової кислоти у дегідроаскорбінову. Ферментативне окислення аскорбінової кислоти може відбуватися прямим шляхом за участю специфічної аскорбатокисдази, а також побічним – через посередництво хінонів та інших окислених продуктів. Хінони при цьому відновлюються, а аскорбінова кислота, окислюючись і перетворюючись на дегідроаскорбінову, служить акцептором водню.

Суть методу

Грунтується на визначенні активності ферменту за швидкістю окислення аскорбінової кислоти методом йодометричного титрування.

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: терези лабораторні аналітичні, порцелянова ступка з товкачиком, колби конічні на 250 см3, колби мірні на 100 см3, склянки хімічні, бюретки, піпетки на 1, 2, 5, 10, 20 см3, палички скляні, секундомір.

Реактиви:

Підготовка до проведення вимірювань:

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1.

Хід аналізу:

- наважку 1…4 г рослинного матеріалу розтирають у ступці з дистильованою водою,

- суспензію переносять у мірну колбу або мірний циліндр на 100 см3,

- розбавляють дистильованою водою до 100 см3, ретельно перемішують;

- суспензію енергійно збовтують і, не допускаючи осідання осаду, відбирають у конічну колбу на 250 см3 20 см3 витяжки,

- до витяжки додають (дослідна проба):

- 1 см3 фосфатного буферного розчину з рН 6,4;

- 5 см3 0,04 н розчину аскорбінової кислоти;

- перемішують протягом 10 хв. на механічній мішалці;

- через 10 хв. реакцію зупиняють додаванням 5 см3 5 % - вого розчину метафосфорної кислоти (або ортофосфорної),

- додають 1 см3 0,5 % - вого розчину крохмалю;

- титрують 0,01 н розчином калій йодатом (КJО3) до появи незникаючого синього забарвлення;

- контрольне титрування:

- беруть 20 см3 витяжки,

- додають 5 см3 5 % - вого розчину метафосфорної кислоти;

- 5 см3 0,04 н розчину аскорбінової кіслоти;

- 1 см3 0,5 % - вого розчину крохмалю;

- титрують 0,01 н розчином КJО3 до появи незникаючого синього забарвлення.

Розрахунки:

Активність аскорбатоксидази A визначають за формулою:

14.6.JPG

де A – активність аскорбатоксидази, в мкмоль аскорбінової кислоти, що окислена за 1 хв. при 20°С на 1 г дослідженої речовини;

100 – загальний об'єм суспензії дослідної тванини, см³,

20 – об'єм суспензії, взятий для визначення, см³,

10 – час дії фермента, хв.,

a – об'єм 0,01 н розчину калій йодату, витраченого на титрування контрольної проби, см³,

b – об'єм 0,01 н розчину калій йодату, витраченого на титрування дослідної проби, см³

5 – коефіцієнт перерахунку мілілітрів 0,01 н розчину аскорбінової кислоти в мікромолі

n – наважка дослідного матеріалу, г.

14.3 Визначення активності поліфенолоксидази у цьому ж розчині

У суспензії, яка залишилась після визначення активності аскорбатоксидази, можна визначити і активність поліфенолоксидази наступним чином:

- суспензію енергійно збовтують і, не допускаючи осідання осаду, відбирають у конічну колбу на 250 см³ 10 см³ витяжки,

- додають 1 см³ фосфатного буферу рН 6,4,

- доливають 5 см³ 0,04 н розчину аскорбінової кислоти,

- перемішують та додають 5 см³ 0,2 % - вого розчину пірокатехіну, одночасно включаючи секундомір;

- реакційну суміш струшують рівномірно, протягом 2 хв.;

- точно через 2 хв. реакцію зупиняють додаванням5 см³ 5 % - вого розчину метафосфорної кислоти,

*Всі розчини повинні мати температуру 20°С, яка створюється шляхом занурення їх у воду з такою температурою.

- залишок аскорбінової кислоти, що не прореагувала, визначають титруванням 0,01 н розчином КJО₃ у присутності 1 см³ 0,5 % - вого розчину крохмалю до появи стійкого синього забарвлення;

- одночасно виконують контрольне титрування:

- у колбу для титрування на 250 см³ відбирають10 см³ суспензії,

- додають 5 см³ метафосфорної кислоти,

- 5 см³ 0,04 н розчину аскорбінової кислоти,

- 1 см³ 0,5 % - вого розчину крохмалю,

- титрують 0,01 н розчином КJО₃ до появи стійкого синього забарвлення.

Розрахунки:

Активність поліфенолоксидази А обчислюють за формулою:

14.7.JPG

де А – активність поліфенолоксидази, в мкмоль окисленої за 1 хв. при 20°С аскорбинової кислоти на 1 г досліджуваної речовини;

100 – загальний об'єм суспензії досліджуваної речовини, в см3;

n – наважка досліджуваної речовини, г,

10 – об'єм суспензії, використаний для визначення активності поліфенолоксидази, см3;

2 – час проведення реакції, хв.;

а – об'єм 0,01 н розчину калій йодату, витраченого на титрування контрольной проби, см3;

b – об'єм 0,01 н розчину калій йодату, витраченого на титрування досліджуваної проби, см3;

5 – коефіціент для перерахунку милілітров 0,01 н розчину аскорбінової кислоти в мікромолі.

14.4 Визначення активності каталази за Х. Н. Починком

Каталаза належить до числа гемопротеїдних ферментів, до складу яких входить залізо. Вона міститься як у рослинних, так і тваринних організмах, каталізує розщеплення гідроген пероксиду на воду та молекулярний кисень:

Підготовка до проведення вимірювань:

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1.

Хід аналізу:

- 1 г свіжого рослинного матеріалу відважують на аналітичних терезах;

- розтирають у порцеляновій ступці з дистильованою водою;

- розтерту масу переносять у мірну колбу на 50 см3;

- отриманий розчин збовтують і, не даючи осаду осісти, набирають 10 см3 суспензії, яку виливають в колбу для титрування на 250 см3;

- додають 1 см3 фосфатного буферного розчину з рН 6,4;

- додають 5 см3 0,04 н розчину аскорбінової кислоти і перемішують;

- додають 5 см3 0,2 % – вого розчину пірокатехіну, одночасно вмикаючи секундомір і струшуючи розчин;

- струшування продовжують протягом 2 хв.;

- точно через 2 хв. реакцію припиняють додаванням 5 см3 5%-вого розчину метафосфорної кислоти (можно замінити ортофосфорною); необхідну кількість кислоти відмірюють у чисту склянку ще до початку досліду;

*Всі розчини повинні мати температуру 20°С, яка створюється шляхом занурення їх у воду з такою температурою.

- проводять титрування 0,01 н розчином калій йодату в присутності 1 см3 0,5 % - вого розчину крохмалю до появи незникаючого синього забарвлення;

- одночасно проводять контрольне титрування: набирають 10 см3 суспензії в колбу для титрування, додають 5 см3 метафосфорної кислоти, 5 см3 0,04 н розчину аскорбінової кислоти і титрують 0,01 н розчином калій йодату в присутності крохмалю.

Розрахунки:

Обчислюють активність поліфенолоксидази А за формулою:

каталаза.JPG

Отже, за нормальних фізіологічних умов каталаза регулює вміст гідроген пероксиду в організмі, запобігає його токсичній дії, відіграє важливу роль у процесі старіння організму.

Метод поширюється на продукти рослинного походження, у тому ж числі фрукти та овочі, а також продукти їх переробки.

Суть методу

Грунтується на визначенні залишку нерозкладеного гідроген пероксиду йодометричним методом. Гідроген пероксид, у присутності молібдату амонію в якості каталізатора реагує з калій йодидом та виділяє йод, який потім відтитровують натрій тіосульфатом. Титруванням контрольного розчину визначають кількість гідроген пероксиду до початку досліду. За різницею результатів контрольного та дослідного титрувань визначають кількість розкладеного гідроген пероксиду, яка характеризує активність каталази.

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: терези лабораторні аналітичні, порцелянова ступка з товкачиком, колби конічні на 250 см3, колби мірні на 100 см3, пробірки мірні на 20 см3, водяна баня, термостат, склянки хімічні, бюретки, піпетки на 1, 2, 5, 10 см3, секундомір.

Реактиви:

- фосфатний буфер рН 7,0 (або СаСО3);

- 0,1 н розчин гідроген пероксиду (0,1 н Н2О2): 3 см3 30 % - вого Н2О2 розводять дистильованою водою до 500 см3; визначають вміст гідроген пероксиду в отриманому розчині йодометричним методом: на 5 см3 цього розчину повинно витрачатися в межах 25 см3 0,02 н розчину натрій тіосульфату; розчин зберігають в темній склянці в прохолодному місці не більше 1 тижня; у день досліджень готують 0,05 н розчин розведенням у 2 рази дистильованою водою.

- розчин сульфатної кислоти Н2SO4 (1:9): в колбу вносять 900 см3 води і приливають при помішуванні 100 см3 сульфатної кислоти густиною 1,84.

- розчин калій йодиду КІ (20 %): 20 г КІ розчиняють у воді, приливають 1 см3 2н розчину їдкого натру, доводять дистильованою водою до 100 см3 і зберігають в темній склянці;

- 2н розчин їдкого натру: 8 г NaOH розчиняють у невеликій кількості води і доводять до кипіння, кип’ятять 30 хв., охолоджують і доводять до 100 см3 водою;

- 10 % - вий розчин амоній молібдату (NH4)2MoO4 або натрій Na2MoO4 (10%): 10 г Na2MoO4•2Н2О розчиняють у невеликій кількості дистильованої води, приливають 0,5 см3 2 н NaOH, нагрівають до кипіння і кип’ятять 15 хв., охолоджують, доводять водою до 100 см3;

- розчин крохмалю (0,5%): 0,5 г крохмалю вносять у мірну колбу на 100 см3, доводять водою до позначки та нагрівають до кипіння;

- 0,02 н розчин натрій тіосульфату Na2S2O3•5H2O: 0,2 г Na2CO3 розчиняють у воді, додають 24,8 г натрій тіосульфату Na2S2O3 5H2O, доводять до 500 см3, перемішують.

Підготовка до проведення вимірювань:

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1.

Хід аналізу:

- наважку рослинного матеріалу 1…2 г ретельно розтирають у ступці з 2 см3 фосфатного буферу рН 7 або з 0,2 г СаСО3;

- вміст ступки переносять у мірну колбу на 100 см3 змиваючи водою;

- об'єм доводять до позначки дистильованою водою та перемішують;

- не допускаючи осідання осаду відбирають 10 см3 суспензії і переносять у мірну пробірку на 20 см3;

- доводять водою до 20 см3;

- пробірку ставлять у ємність з водою температурою 20 °С;

- за досягнення заданої температури додають 5 см3 0,1н Н2О2, перемішують;

- точно через 5 хв. додають:

- 5 см3 розчину Н2SO4 (1 : 9);

- 1 см3 20 % - вого КІ;

- 3 краплі 10 % - вого (NH4)2MoO4 (або Na2MoO4);

- 1 см3 0,5 % - вого крохмалю;

- титрують 0,02 н Na2S2O3•5H2O до стійкого синього забарвлення;

- одночасно виконують контрольне титрування:

- не допускаючи осідання осаду відбирають 10 см3 суспензії і переносять у мірну пробірку на 20 см3;

- доводять водою до 20 см3;

- пробірку ставлять у ємність з водою температурою 20 °С;

- за досягнення заданої температури додають 5 см3 розчину Н2SO4 (1 : 9) та перемішують та додають:

- 5 см3 0,1 н Н2О2;

- 1 см3 20 % - вого КІ;

- 3 краплі 10 % - вого (NH4)2MoO4 (або Na2MoO4);

- 1 см3 0,5 % - вого крохмалю;

- титрують 0,02 н розчином Na2S2O3•5H2O до стійкого синього забарвлення.

Розрахунки:

Активність каталази А обчислюють за формулою:

14.8.JPG

де А – активність каталази, мкмоль Н2О2 розкладеного 1 г досліджуваної речовини протягом 1 хв. при 20 °С;

100 – загальний об'єм суспензії досліджуваного розчину, см3;

n – наважка досліджуваного матеріалу, г;

10 – об'єм суспензії досліджуваної речовини, см3;

5 – час взаємодії ферменту з пероксидом водню, хв.;

a – об'єм 0,02 н розчину натрій тіосульфату, витраченого на титрування контрольного розчину, см3;

b – об'єм 0,02 н натрій тіосульфату, витраченого на титрування дослідного розчину, см3;

293 – коефіцієнт перерахунку витраченого гідроген пероксиду, мкмоль;

(a – b) повинно бути в межах від 8 до 23 см3, при a равном 25…26 см3.

Розрахунки можна виконувати за менш складною, але і менш точною формулою:

14.9.JPG

де А – активність каталази, мкмоль Н2О2 розкладеного 1 г досліджуваної речовини протягом 1 хв. при 20 °С;

(a – b) повинно бути в межах від 2 до 15 см3;

10' - коефіцієнт перерахунку мілілітрів 0,02 н розчину гідроген пероксиду в мікромолі (0,00034/0,000034 = 10). Усі інші позначення як у поперердній формулі.

*При визначенні активності каталази в об'єктах з високим вмістом крохмалю ( бульби картоплі, насіння злакових культур, тощо) необхідно перед визначенням дати крохмалю осісти та для дослідження відбирати суспензію без осаду крохмалю. В цьому випадку індикатор – розчин крохмалю можна не додавати, так як його вистачає у суспензії.

Визначення активності поліфенолоксидази та пероксидази у цьому ж розчині. Після визначення активності каталази у залишку досліджуваного розчину можна визначити активність пероксидази та поліфенолоксидази наступним чином:

1.Визначення активності поліфенолоксидази:

- суспензію, яка залишилась після визначення каталази, ретельно збовтують;

- не допускаючи осідання осаду, відбирають 10 см3 у конічну колбу на 250 см3 та додають:

- 1 см3 фосфатного буфера рН 6,4;

- 5 см3 0,04 н розчину аскорбінової кислоти, перемішують,

- 5 см3 0,2% - ного розчину пірокатехіну, одночасно вмикають секундомір та безперервно струшують розчин;

*Всі розчини повинні мати температуру 20°С, яка створюється шляхом занурення їх у воду з такою температурою.

Розрахунки:

Обчислюють активність поліфенолоксидази А за формулою 14.5.

2.Визначення активності пероксидази:

Реактиви:

- розчин кальцій нітрату (5 % -вий): у якості початкового готують 50 % - вий розчин: 500 г Ca(NO3)2•4H2O розчиняють у 500 см3 дистильованої води та розбавляють водою до 1000 см3, перемішують. У день досліджень із даного розчину готують 5 % -вий розбавленням водою у 10 разів.

- розчин гваяколу (0,3%-вий): твердий гваякол у банці занурюють у теплу воду; після охолодження беруть піпеткою 0,6 см3 гваяколу, приливають 100 см3 дистильваної води, яка знаходиться у мірній колбі на 200 см3, перемішують до розчинення гваяколу, доводять водою до позначки 200 см3, перемішують та залишають у темній склянці.

- розчин гідроген пероксиду (0,05 н): 0,5 см3 30 % -вого розчину гідроген пероксиду розчиняють дистильованою водою до 150 см3. У цьому розчині перевіряють вміст гідроген пероксиду наступним чином: 5 см3 розчину відбирають в колбу для титрування, додають 5 см3 4 н розчину сульфатної кислоти та титрують 0,05 н розчином калій перманганату до появи стійкого рожевого забарвлення. Повинно бути витрачено близько 5 см3 розчину калій перманганату. У випадку відхилення розчин доводять до 0,05 н розбавленням або додаванням пергідролю. Зберігають розчин 2…3 доби.

- розчин амоній персульфіту (3 % -вий): 3 г солі розчиняють у дистильованій воді та розбавляють водою до 100 см3; готують у день досліджень.

- стандартний розчин аргентум нітрату: 0,1968 г аргентум нітрату розчиняють дистильованою водою у колбі на 250 см3, доливають до позначки, перемішують, зберігають у темній склянці. 1 см3 такого розчину містить 0,5 мг Ag.

Хід аналізу:

- суспензію, яка залишилась після визначення каталази, ретельно збовтують;

- не допускаючи осідання осаду, відбирають 25 см3 у мірну колбу на 50 см3,

- доводять до позначки 10 % - вим кальцій нітратом,

- перемішують та залишають на 30…40 хв. при періодичному перемішуванні,

- суспензію фільтрують через сухий фільтр,

- першу порцію фільтрату (5…10 см3) відкидають,

- з іншої частини фільтрату відбирають 2 см3 (при дослідженні пшениці – 0,5 см3) суспензії,

- переносять у суху пробірку,

- доводять дистильованою водою до 8 см3,

- додають 1 см3 0,3 % - вий розчин гваякола та перемішують,

- пробірку поміщають у воду з температурою 20 °С,

- доливають 1 см3 0,05 н розчину Н2О2,

- перемішують та залишають у воді, підтримуючи її температуру 20 °С;

- через 15 хв. витримки вимірюють оптичну густину за 440 нм в кюветі з довжиною шляху 10 мм,

- розчином для порівняння виступає досліджувана суспензія, взята у такій же самій кількості, як і в досліді, та доведена до 10 см3 дистильованою водою;

- результати порівнюють з калібрувальним графіком, який побудований для срібла, і за відповідною кількістю срібла розраховують активність пероксидази за формулою:

14.10.JPG

де A – активність пероксидази при 20 °С, мкмоль гваякола окисленого протягом 1 хв. за дії фермента, який міститься у г досліджуваної речовини,

C – концентрація срібла, мг/см3,

a – об'єм досліджуваного розчину, взятий для реакції з гваяколом, см3,

n – наважка досліджуваної сировини, г,

50 – об'єм витяжки із наважки, см3,

10 – об'єм колориметрованого розчину, см3,

15 – час дії фермента, хв.,

2,53 – кількість мікромолей гваякола, що окислюється за 15 хв. у присутності 1 мг срібла за 20 °С.

Побудова калібрувального графіка:

- у ряд пробірок наливають 0,1; 1; 2; 3; 4; 5 і 6 см3 розчину аргентум нітрату, який містить 0,5 мг Ag в 1 см3 розчину,

- доливають дистильованою водою до 8 см3,

- додають по 1 см3 0,3 % - вого розчину гваякола та перемішують,

- пробірки занурюють у воду з температурою 20°С,

- додають з перервами в 1 хв. по 1 см3 3 % - вого розчину амоній персульфату, перемішують а ставлять на витримку,

- точно через 15 хв. після додавання амоній персульфату в першій пробірці вимірюють інтенсивність забарвлення розчину,

- в інших пробірках – через такий самий проміжок часу з інтервалами між вимірюваннями в 1 хв., з урахуванням додавання амоній персульфату,

- інтенсивність забарвлення вимірюють при 440 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм,

На основі отриманих результатів вимірювань будують калібрувальний графік.

14.5 Визначення активності каталази за М. А. Королюком

Метод поширюється на продукти тваринного походження, а також на м'ясні та м'ясорослинні продукти.

Суть методу

Грунтується на здатності гідроген пероксиду утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс.

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: пробірки склянні на 10 см3, піпетки на 0,1; 1; 2; 5 см3, терези лабораторні аналітичні, колби мірні на 50, 100 см3, центрифуга, центрифужні пробірки, ультратермостат, електросушарка, спектрофотометр, морозильні шафи, гомогенізатор.

Реактиви:

- розчин гідроген пероксиду H2O2 (0,03%): 0,1 см3 30% H2O2 доводять дистильованою до 100 см3 H2O;

- розчин амоній молібдату (NH4)2MoO4 (4%):4 г амоній молібдату розчиняють у дистильованій воді та доводять до 100 см3;

- фосфатний буфер 7,4,

- етиловий спирт 96 % - вий,

- хлороформ,

- кристалічний однозаміщений фосфат калію KH2PO4.

Підготовка до проведення вимірювань:

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1.

- Проби, які надходять у лабораторію повинні бути без пошкоджень і змін якості продукту при транспортуванні та зберіганні.

Хід аналізу:

1.Підготовка тканини для визначення активності ферментів

- 1г тканини гомогенізують при охолодженні в 9 см3 фосфатного буферу 7,4 та заморожують;

- після розморожування гомогенат центрифугують 5 хв. при 4000 об/хв.;

- в пробірку для центрифугування додають 2 см3 гомогената, 0,6 см3 етилового спирту (96%), 0,3 см3 хлороформу (CHCl3), 0,9 г кристалічного однозаміщеного фосфату калію KH2PO4 ;

- осаджують сполуки, що перешкоджають визначенню активності ферментів перемішуванням при охолодженні впродовж 15хв.;

- після цього пробірки герметично закривають;

- центрифугують 30 хв. ( 8000 об./хв.) при охолодженні;

- отриманий супернатант зливають у чистий посуд і витримують 48 годин за температури -180С.

*Отриманий супернатант використовують для дослідження активності ферментів: каталази, супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази.

2.Визначення активності каталази:

- дослідна проба: до 2 см3 розчину гідроген пероксиду (0,03%) у пробірки додають 1 см3 супернатанту;

- контрольна проба: до 2 см3 розчину гідроген пероксиду (0,03%) у пробірки додають 1 см3 дистильованої води;

- вміст обох пробірок занурюють у водяну баню;

- проводять інкубацію при 37 °C протягом 10 хвилин;

- реакцію в пробірках зупиняють додаванням 1 см3 4 % - вого розчину амоній молібдату (NH4)2MoO4 ;

- вміст пробірок центрифугують 10 хв. при 6000 об./хв.

- проводять вимірювання оптичної густини отриманої рідини на спектрофотометрі при довжині хвилі 410 нм проти розчину порівняння, в який замість гідроген пероксиду додають 2 см3 дистильованої води.

Розрахунки:

Визначeння активнoсті каталази А, у мкмоль /см3 хв., проводять за формулою:

14.11.JPG

де А- активність ферменту, мкмоль /см3 хв.;

Ек- оптична густина контрольної проби;

ЕД- оптична густина дослідної проби.

0,003 – кількість H2O2 у мкмоль/см3хв., що розкладається за 1хв. у 1 см3 розчину.

14.6 Визначення активності супероксиддисмутази за О. П. Макаревичем, П. П. Голіковим

Супероксиддисмутаза (СОД) – входить до ензимгрупи антиоксидантних ферментів. Разом з каталозою та іншими антиоксидантними ферментами захищає організм від високотоксичних кисневих радикалів. Вона каталізує дисмутацію супероксиду в кисень і пероксид водню. Таким чином, СОД відіграє найважливішу роль у антиоксидантному захисті практично всіх типів клітин, які так або інакше знаходяться у контакті з киснем.

Метод поширюється на продукти тваринного походження, а також на м'ясні та м'ясорослинні продукти.

Суть методу

Грунтується на конкуруванні СОД з нітросинім тетразолієм (НСТ) за супероксидрадикали, які утворюються в результаті аеробної взаємодії відновленої форми НАДН та фенозинметасульфату (ФМС). В результаті цієї реакції НСТ відновлюється до гідрозинтетразолію. У присутності СОД відсоток відновлення НСТ знижується. Висновки про активність СОД у надосадовій рідині роблять за ступенем ингібування відновленого НСТ у присутності НАДН і ФМС.

Реактиви:

- фосфатний буфер (рН=7,4),

- етиловий спирт 96 % - вий,

- хлороформ,

- кристалічний однозаміщений фосфат калію (KH2PO4).

- фосфатний буфер рН=7,8: до 190,2 см3 розчину Na2НРО4•12Н2О додають 9,8 см3 розчину КН2РО4;

- розчин Na2НРО4•12Н2О: 5,9667 г солі розчиняють у дистильованій воді та доводять до 250 см3;

- розчин КН2РО4: 0,9073 г солі розчиняють у дистильованій воді та доводять до 100 см3;

- розчин етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА, 1,3мкМ): 0,0192 г ЕДТА розчиняють у 50 см3 фосфатного буфера рН=7,8;

- розчин трис-ЕДТА рН=8,0 (1мМ): змішують 2 розчини (а і b) у співвідношенні 1:1;

- розчин ЕДТА: 0,0590305 г ЕДТА розчиняють у дистильованій воді та доводять до 250 см3;

- розчин трис: 0,06057 г трис розчиняють у дистильованій воді та доводять до 250 см3;

- розчин нітросинього тетразолію (НСТ, 0,543 мМ): 0,0479 г НСТ розчиняють у 10 см3 фосфатного буфера рН=7,8;

- розчин фенозинметасульфату (ФМС, 2,4 мкМ): 0,0037 г ФМС розчиняють у 50 см3 фосфатного буфера рН=7,8;

- розчин НАДН (10 мМ): 0,0355 г НАДН розчиняють у 5 см3 1мМ трис-ЕДТА рН=8,0.

Підготовка до проведення вимірювань:

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1. Проби, які надходять у лабораторію повинні бути без пошкоджень і змін якості продукту при транспортуванні та зберіганні.

Хід аналізу:

1.Підготовка тканини для визначення активності ферментів

- 1г тканини гомогенізують при охолодженні в 9 см3 фосфатного буферу 7,4 та заморожують;

- після розморожування гомогенат центрифугують 5 хв. при 4000 об/хв.;

- в пробірку для центрифугування додають 2 см3 гомогенату, 0,6 см3 етилового спирту (96%), 0,3 см3 хлороформу (CHCl3), 0,9 г кристалічного однозаміщеного фосфату калію KH2PO4 ;

- після цього пробірки герметично закривають;

- центрифугують 30 хв. ( 8000 об./хв.) при охолодженні;

- отриманий супернатант зливають у чистий посуд і витримують 48 годин за температури -180С.

2.Визначення активності СОД:

- приготування інкубаційної суміші (дослідної): у пробірку додають:

- 0,2 см3 розчину ЕДТА,

- 0,1 см3 розчину НСТ,

- 0,5 см3 розчину ФМС,

- 0,1 см3 супернатанту,

- 3 см3 фосфатного буферу рН = 7,8;

- приготування контрольної суміші: у пробірку додають:

- 0,2 см3 розчину ЕДТА,

- 0,1 см3 розчину НСТ,

- 0,5 см3 розчину ФМС,

- 3,1 см3 фосфатного буферу рН = 7,8

- приготування суміші для порівняння: у пробірку додають:

- 0,2 см3 розчину ЕДТА,

- 0,1 см3 розчину НСТ,

- 0,5 см3 розчину ФМС,

- 0,1 см3 розчину трис-ЕДТА;

- 3,1 см3 фосфатного буферу рН = 7,8;

- запускають реакцію додаванням 0,1 см3 10 мМ НАДН в інкубаційну та контрольну суміші (в суміш для порівняння не додають);

- суміші інкубують 10 хв. у темному місці за кімнатної температури;

- через 10 хв. проводять вимірювання величини оптичної густини інкубаційної та контрольної суміші при λ = 540 нм навпроти суміші для порівняння.

Розрахунки:

Для розрахунку активності СОД спочатку визначають відсоток гальмування реакції відновлення НСТ у дослідній пробі за 1хв. (Т, %) за формулою :

14.12.JPG

де ЕК - оптична густина контрольної проби;

ЕО - оптична густина дослідної проби;

10 - час інкубації, хв.

Активність СОД А розраховують за формулою:

14.13.JPG

де А - активність СОД, у.о./хв.г;

N - кінцеве разведення матеріалу, який досліджується.

14.7 Визначення активності супероксиддисмутази в плодоовочевій та ягідній продукції за Т. В. Сиротою

Суть методу

грунтується на здатності супероксиддисмутази (СОД) інгібувати реакцію аутоокиснення адреналіну в лужному середовищі.

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: пробірки склянні на 10 см3, піпетки на 0,1; 1; 2; 5 см3, терези лабораторні аналітичні, колби мірні на 50, 100 см3, центрифуга, центрифужні пробірки, спектрофотометр, ступка порцелянова з товкачиком, льодяна баня, товчене скло.

Реактиви:

- вода дистильована, фосфатний буфер рН=7,8, хлороформ, спирт етиловий (96%),

- розчин адреналіну 0,1% - вий (5,46 мМ): до 3 см3 0,182 % - вого адреналіну додають 2,45 см3 дистильованої води;

- бікарбонатний буфер рН=10,65: до 0,2 М розчину Na2CO3 додають сухий NaHCO3 до встановлення рН=10,65.

Підготовка до проведення вимірювань:

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1.

Хід аналізу:

- зважують 0,5 г середньої проби матеріалу,

- додають 5 см3 фосфатного буфера рН=7,8,

- подрібнюють та перетирають у ступці зі склом на льодяній бані;

- отриману суміш переносять у центрифужні пробірки,

- додають 0,3 см3 хлороформу та 0,6 см3 спирту;

- центрифугують 20 хв. при 8000 об.;

- супернатант переносять у пробірки;

- приготування контрольної проби:

- К1 – бікарбонатний буфер рН=10,65;

- Д1 – до 20 см3 бікарбонатного буфера рН=10,65 додають 1 см3 адреналіну;

- через 3 хв. вимірюють оптичну густину розчину Д1 проти К1 при λ=347 нм,

- приготування дослідної проби:

- К2 – до 20 см3 бікарбонатного буфера рН=10,65 додають 1 см3 проби;

- Д2 – до 20 см3 бікарбонатного буфера рН=10,65 додають 1 см3 проби та 1 см3 адреналіну;

- через 3 хв. вимірюють оптичну густину розчину Д2 проти К2 при λ=347 нм.

Розрахунки:

Активність СОД А, виражену в умовних одиницях, які характеризують відсоток інгібування аутоокиснення адреналіну, визначають за формулою:

14.14.JPG

де А – активність СОД, % інгібування,

ΔDДОСЛ – зміна величини оптичної густини дослідної проби при λ=347 нм через 3 хв. від початку реєстрації процеса окислення адреналіну,

ΔDКОН – зміна величини оптичної густини контрольної проби при λ=347 нм через 3 хв. від початку реєстрації процеса окислення адреналіну.

Значення активності СОД А більше 10% свідчить про наявність антиоксидантної активності.

14.8 Визначення активності глутатіонпероксидази за А. Р. Гавриловою, Н. Ф. Хмарою

Глутатіонпероксидаза (ГПО) - фермент антиоксидантної системи, який захищає організм від оксидативного стресу. Каталізує розпад ліпідних пероксидаз і гідроген пероксиду, змушує пероксидні радикали вступати у реакцію один з одним, після чого утворюються вода і кисень.

Глутатионпероксидаза захищає від окисної атаки білки, ліпіди, відновлює ліпідні пероксиди. Вона містить селен. Для збереження активності глутатіонпероксидази, крім селену, необхідні вітаміни А, С, Е, S - місні амінокислоти і глутатіон. Весь цей глутатіонферментний комплекс запобігає порушенню клітинних мембран від руйнування пероксидів.

Фермент локалізований у цитоплазмі в невеликих кількостях, а також в мітохондріях. У тканинах максимальна активність глутатіонпероксидази в печінці, еритроцитах, наднирниках. Активність ферменту залежить від кількості утворених пероксидів.

Метод поширюється на продукти тваринного походження, а також на м'ясні та м'ясорослинні продукти.

Суть методу

Грунтується на відновленні ГПО за допомогою GSH гідропероксидом трет-бутилом. Залишок відновленого глутатіону визначається за інтенсивністю забарвлення з натрій нітропрусидом, який має максимум поглинання при λ = 540 нм. Активність ГПО оцінюється за зниженням вмісту глутатиону.

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: пробірки склянні на 10 см3, піпетки на 0,1; 1; 2; 5 см3, терези лабораторні аналітичні, колби мірні на 50, 100 см3, центрифуга, центрифужні пробірки, фотоелектрокалориметр, ультратермостат або водяна баня, гомогенізатор.

Реактиви:

- фосфатний буфер рН=7,4: до 80,2 см3 Na2НРО4 (1М) додати 19,8 см3 КН2РО4 (1М),

- розчин Na2НРО4 (1М): 0,9467 г Na2НРО4 або 1,90402 г Na2НРО4•12Н2О розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3,

- розчин КН2РО4 (1 М): 0,6849 г КН2РО4 розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3,

- гідропероксид трет-бутилу (CH3)3COOH (8,0мМ): 0,5 см3 84 % - го розчину (CH3)3COOH розвести дистильованою водою у колбі на 500 см3,

- трихлороцтова кислота (ТХО), 5%-й розчин: 5,0 г кислоти розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3,

- розчин Na2CO3, 1,8М: 19,8 г Na2CO3 або 51,48 г кристалогідрату Na2CO3•10Н2О розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3,

- розчин натрій нітропрусиду Na 2[Fe(CN)5NO]: 2,0960 г Na2[Fe(CN)5NO] розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3,

- розчин 2,0 мМ ЕДТА і 20мМ GSH: 0,004722 г ЕДТА та 0,061466 г GSH розчинити в 10 см3 фосфатного буферу рН=7,4.

Підготовка до проведення вимірювань:

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1.

Хід аналізу:

1.Підготовка тканини для визначення активності ферментів

- 1г тканини гомогенізують при охолодженні в 9 см3 фосфатного буферу 7,4 та заморожують;

- після розморожування гомогенат центрифугують 5 хв. при 4000 об/хв.;

- після цього пробірки герметично закривають;

- центрифугують 30 хв. ( 8000 об./хв.) при охолодженні;

- отриманий супернатант зливають у чистий посуд і витримують 48 годин за температури -180С.

2.Визначення активності ГПО

- дослідна проба: до 0,1 см3 супернатанту тканини додають 0,3 см3 2,0 мМ ЕДТА і 20мМ GSH,

- контрольна проба 1(контроль 1): до 0,1 см3 дистильованої води додають 0,3 см3 2,0 мМ ЕДТА і 20мМ GSH,

- контрольна проба 2 (контроль 2): до 0,1 см3 дистильованої води додають 0,3 см3 фосфатного буферу рН=7,4,

- проба для порівняння: до 0,2 см3 дистильованої води додають 0,3 см3 2,0 мМ ЕДТА і 20мМ GSH,

- проби прогрівають до 37 °С,

- у дослідній та контрольних пробірках (у пробу для порівняння не додають) запускають реакцію додаванням 0,1 см3 8,0 мМ гідропероксиду трет-бутилу,

- проводять реакцію при 37 °С та зупиняють через 10 хв. додаванням 1,0 см3 5 % - вого розчину ТХО у всі чотири пробірки,

- проби центрифугують 15 хв. при 4000 об./хв.,

- відбирають 0,1 см3 надосадової рідини,

- додають до 4,0 см3 насиченого розчину NaCl,

- додають 0,5 см3 0,08 М натрій нітропрусиду,

- безпосередньо перед вимірюванням оптичної густини додають 0,5 см3 1,8 М натрій карбонату,

- ретельно перемішують та миттєво фотометрують при λ = 540 нм проти дистильованої води,

- фонове поглинання натрій нітропрусиду визначають у пробі, яка містить: 0,1 см3 дистильованої води, 4,0 см3 насиченого розчину NaCl, 0,5 см3 0,08 М натрій нітропрусиду, 0,5 см3 1,8 М натрій карбонату.

Розрахунки:

Активність ГПО в 1см3 гомогенату розраховується за формулою

14.15.JPG

де А - активність ГПО, мкМGSH/ хв.г.,

– вихідна стандартна концентрація GSH;

t - час реакції, хв.;

N - фактор разведення реакційної суміші;

Еоп - екстинція дослідної проби;

Ек1 - екстинція контрольної проби, яка містить GSH;

Ек2 - екстинція контрольної проби, яка не містить GSH;

Ев - екстинція проби для порівняння;

Е ф - екстинція фонової проби.

14.9 Визначення активності дегідрогеназ циклу кребса за Н. Д. Єщенком, Г. Г. Вольским та S. Hein, А. Steinbüchel

Метод поширюється на продукти тваринного походження, а також на м'ясні та м'ясорослинні продукти.

Суть методу:

пoлягає у віднoвлeнні K3[Fe(CN)6], рoзчин якoгo має жoвтe забарвлeння, дo бeзкoльoрoвoгo K4[Fe(CN)6] субстратoм активації під дією відпoвіднoї дeгідрoгeнази. Активність фeрмeнтів прoпoрційна кількoсті віднoвлeнoгo фeрoціаніду.

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: пробірки склянні на 10 см3, піпетки на 0,1; 1; 2; 5 см3, терези лабораторні аналітичні, каталізатор, порцелянова ступка, колби мірні на 50, 100 см3, центрифуга, центрифужні пробірки, фотоелектрокалориметр, ультратермостат або водяна баня.

Реактиви:

- фосфатний буфер, рН=7,4: до 80,2 см3 1 М розчину Na2НРО4 додати 19,8 см3 1 М розчину КН2РО4,

- розчин Na2НРО4, 1 М: 0,9467 г Na2НРО4 або 1,90402 г Na2НРО4•12Н2О розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3;

- розчин КН2РО4 , 1 М: 0,6849 г КН2РО4 розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3,

- розчин MgCl2: 1,5 г MgCl2 розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3,

- ЕДТА: 0,584 г розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3,

- "α" - оксоглутарова кислота: 2,92 г розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3,

- бурштинова кислота: 4,72 г кислоти розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3,

- розчин K3[Fe(CN)6]: 0,219 г розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3;

- трихлороцтова кислота, 35 % - вий розчин: 35 г ТХО розчинити у дистильованій воді та довести до 100 см3.

Підготовка до проведення вимірювань

- Відбір середньої проби та підготовка її до аналізу виконують згідно пункту 7.1.1.

Хід аналізу:

1.Приготування гомогенату:

- наважку тканини (0,5 г) пeрeносять дo порцелянової ступки,

- дoдають 4,5 см3 oхoлoджeнoгo фoсфатнoгo буфeру (рН=7,4),

- ступку утримують у кристалізатoрі, напoвнeнoму льoдoм та вoдoю,

- тканину в ступці руйнують кругoвими рухами тoвкачиком впродовж 15 хв.,

- отриманий гомогенат центрифугують 5 хв. при 5000 об./хв.,

- супернатант використовують для дослідження.

2.Вимірювання активності ферментів:

- гoтують стандартнe інкубаційнe сeрeдoвищe (дослідний розчин):

- 2,3 см3 фосфатного буфера рН=7,4,

- 0,1 см3 розчину MgCl2,

- 0,1 см3 ЕДТА,

- 0,7 см3 розчину K3[Fe(CN)6],

- в залежності від досліджуваної дегідрогенази (сукцинатдегідрогенази або 2-оксоглутаратдегідрогенизи), відповідно додають 0,1 см3 бурштинової кислоти або 0,1 см3 α- оксоглутарової кислоти (субстракт активації);

- рeакцію рoзпoчинають дoдаванням 0,4 см3 суспeнзії тканиннoгo гoмoгeнату;

- гoтують контрольний розчин:

- 2,3 см3 фосфатного буфера рН=7,4,

- 0,1 см3 розчину MgCl2,

- 0,1 см3 ЕДТА,

- 0,7 см3 розчину K3[Fe(CN)6],

- 0,1 см3 дистильованої вoди,

- 0,4 см3 фосфатного буферу з рН=7,4;

- після дoдавання гoмoгeнату дослідні та контрольні прoбірки занурюють у вoдяну баню,

- прoводять інкубацію при 37°C впродовж 30 хв. при визначенні активності SD, та впродовж 60 хв. при визначенні активності 2-OGD,

- після інкубації дo кoжнoї прoбірки додають пo 0,3 см3 трихлoрoцтoвoї кислoти (ТХО),

- для видалeння oсаду прoбірки цeнтрифугують при 5000 oб. 5 хв.,

- проводять вимірювання оптичної густини отриманої рідини на спeктрoфoтoмeтрі при λ=417 нм в кюветах напроти води.

Розрахунки:

Визначeння фeрмeнтативнoї активнoсті А виконують за фoрмулою:

14.16.JPG

де А – активність (мкМоль*хв-1*г-1);

DK – оптична густина контрольної проби;

DO – оптична густина дослідної проби;

m – наважка тканини в інкубаційному середовищі (0,04 г);

T – час інкубації, хв.

Дослідницький практикум Частина 1

14.ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ

ЗМІСТ