10.МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ БІЛКА

Білки – високомолекулярні біополімери, структурними елементами яких є амінокислоти. За своєю хімічною природою білки найбільш складні з відомих сполук нітрогену.

До складу білків входять такі елементи: карбон (50,5…54,5 %), гідроген (6,7…7,3), оксиген (21,5…23,5), нітроген (15…17 %), сульфур (0,3…2,5 %) й часто фосфор.

Молекулярна маса білків коливається в дуже широких межах: від 10000 до кількох сотен тисяч й більше. Фізико-хімічні властивості білків визначаються не лише їхньою структурою, але й якісним і кількісним складом амінокислот.

Найбільш відомим методом для кількісного визначення білків є метод Лоурі, однак в сучасній літературі описані ще декілька спектрофотометричних методів їх визначення. Об'єднує ці методи процес екстракції білків.

10.1  Екстракція білків

- 1..2 г дослідного матеріалу подрібнюють у ступці або гомогенізаторі;

- екстрагують тричі по 10 хв. 15 см3 охолодженого ацетону;

- розчинник видаляють на роторному випарювачі або у вакуум-ексикаторі до одержання порошка;

- сухий порошок розчиняють у 15…20 см3 0,1 М розчину фосфатного буфера (рН 7,0), що містить 0,1 М хлориду натру протягом 30 хв.;

- одержану суміш центрифугують при 3000 об/хв протягом 20 хв.;

- відділену надосадову рідину розглядають як вихідний екстракт для подальшого визначення білка.

10.2 Визначення білка в рослинному матеріалі за методом О. Г. Варбурга та Е. Кристіана

Суть методу

Грунтується на здатності ароматичних амінокислот (триптофану, тирозину й в меншій мірі фенілаланіну) поглинати УФ – промені з максимумом при 280 нм.

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: ступка з товкачиком, мірні пробірки на 10 см3, мірні циліндри на 10…100 см3; роторний випаровувач або вакуум-ексикатор, центрифужні пробірки, центрифуга, рН-метр.

Реактиви: ацетон, KH2PO4 або K2HPO4, Na2HPO4 або NaH2PO4 для приготування фосфатного буфера, хлорид натру.

Хід аналізу:

- надосадову рідину, одержану вище описаним способом (п.10.1), поміщають в кювету спектрофотометра;

- за нульовий розчин служить 0,1 м фосфатний буфер (рН 7), що містить 0,1 М хлорид натру;

- оптичну густину вимірюють при довжині хвилі 260 й 280 нм: оскільки білки відрізняються за вмістом ароматичних амінокислот, їх поглинання в УФ ділянці спектра може значно розрізнятися. Умовно вважають, що при концентрації «середньої» кількості білка в розчині, яка становить 1 мг/см3, величина оптичної густини при 280 нм дорівнює 1,0 (при товщині шару рідини 1 см).

Визначенню білків цим методом заважає наявність нуклеїнових кислот й нуклеотидів. Вимірюючи оптичну густину розчинів при 260 та 280 нм для врахування поглинання сполук нуклеотидної природи, вміст білка обчислюють за допомогою номограми (рис. 32). При цьому експериментально одержані величини оптичної густини при 260 та 280 нм знаходять у відповідних стовпчиках номограми й з'єднують їх прямою лінією: місце перетину цієї прямої зі шкалою, на якій представлена концентрація білка, визначає його вміст у дослідному розчині.

         Розрахунки

         Вміст білка в досліджуваній біомасі можна знайти також за формулою Калькара на основі даних визначення оптичної густини при 280 та 260 нм:

  10.1.JPG

де А – вміст білка, мг/см3;

     D280 , D260  - оптична густина за відповідних довжин хвиль.

Обчислюють відношення D280/D260 за допомогою табл. 10.1 або графіка, побудованого за наведеними у таблиці даними. Знаходять множник f, що відповідає  D280/D260. Тоді вміст білка визначають за формулою:

      10.2.JPG

Таблиця 10.1

Множники f для обчислення концентрації білка

D280/D260

Вміст нуклеїнової кислоти*, %

Множник

f

D280/D260

Вміст нуклеїнової кислоти*, %

Множник

f

1,75

0

1,118

0,86

5,2

0,671

1,60

0,30

1,078

0,84

5,6

0,650

1,50

0,56

1,047

0,82

6,1

0,628

1,40

0,87

1,011

0,80

6,6

0,605

1,30

1,26

0,969

0,78

7,1

0,581

1,25

1,49

0,946

0,76

7,8

0,555

1,20

1,75

0,921

0,74

8,5

0,528

1,15

2,05

0,893

0,72

9,3

0,500

1,10

2,4

0,863

0,70

10,3

0,470

1,05

2,8

0,831

0,68

11,4

0,738

1,00

3,3

0,794

0,66

12,8

0,404

0,96

3,7

0,763

0,64

14,5

0,368

0,92

4,3

0,728

0,62

16,6

0,330

0,90

4,6

0,710

0,60

19,2

0,289

0,88

4,9

0,691

* Вміст нуклеїнових кислот відносно загальної концентрації білка (білок+НК)

32.JPG

10.3 Спектрофотометричний метод визначення білка

Суть методу

Полягає у зв'язуванні з білками одного з кислих барвників кумассі синього, який виробляють у двох модифікаціях: R-250 і G-250. При зв'язуванні з білками спектр поглинання барвника змінюється: інтенсивність

забарвлення залежить від концентрації білка в пробі, а в діапазоні 1 – 10 мкг/см3 ці зміни дають лінійну залежність.

Багато з досліджуваних сполук (фосфат, цитрат, пірофосфат, ацетат, HEPES, MOPS, MES, BES, PIPES, трис, форміат, ЕДТА, гліцин, тирозин, а також аденозин, АТФ, тимідин, ДНК, РНК, поліаденілова кислота) не впливають на розвиток забарвлення. Наявність в середовищі інкубації амфолінів викликає значне збільшення оптичної густини. Оскільки білки розрізняються за своєю здатністю зв'язувати барвники, бажано будувати калібрувальні графіки з використанням того білка, концентрацію якого в подальшому прагнуть визначити.

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: гомогенізатор, мірні колби, піпетки, мірні целіндри, спектрофотометр, пробірки, секундомір.

Реактиви стандартний розчин білка, що містить його 0,05 мг/см3, етанол (95 %), фосфорна кислота (85 %),

Розчин барвника кумассі синього, який виготовлений за одним із двох варіантів:

- Реактив А. 100 мг кумассі яскраво-синього G-250 гомогенізують в скляному гомогенізаторі в 50 см3 95 %-вого етанолу; одержаний розчин змішують з 100 см3 85 %-вої фосфорної кислоти; суміш доводять до 1000 см3 дистильованою водою, фільтрують, зберігають при кімнатній температурі 2 тижня.

- Реактив Б. 60 мг кумассі яскраво-синього G-250 розчиняють у 1000 см3 3 %-вої надхлоридної кислоти й фільтрують для усунення залишків нерозчиненого барвника. Величина поглинання світла (оптична густина) розчину при 465 нм повинна бути між 1,3 й 1,5. Цей розчин зберігається необмежено довго.

Виготовлений реактив називають розчином Бредфорда, який має максимум поглинання 595 нм, тобто у видимій частині спектра.

Хід аналізу

- при визначенні білка 1,5 см3 дослідного розчину, що містить від 10 до 50 мкг білка, змішують з 1,5 см3 розчину Бредфорда;

- через 20…30 хв. вимірюють поглинання світла при 595 нм, використовуючи як нульовий (контрольний) розчин пробу, що не містить білків;

- концентрацію білка в пробі визначають за допомогою калібрувального графіка, який будують  на основі ряду точно виготовлених білкових розчинів;

- для виготовлення останніх використовують кристалічний препарат чистого білка;

Якщо мають справу з концентрованими білковими розчинами (˃5 мг/см3), зручніше брати 1,5 см3 води або розбавленого розчину хлористого натру, додати дослідний розчин мікролітровим шприцем, розчин ретельно перемішати і потім до нього додати барвник. Концентрований білковий розчин при контакті з барвником утворює осад. Реактив А дає більш високе поглинання, ніж реактив Б, але він менш стійкий при зберіганні.

         Побудова калібрувального графіка

         Використовують кристалічний препарат чистого дослідного білка, білок яйця або альбумін сироватки.

- 30 мг білка розчиняють в 100 см3 води (розчинність 100 %);

- З цього розчину відбирають серію пробірок відповідно 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 см3 розчину білка;

- в кожну пробірку додають по 1,5 см3 дистильованої води;

- розчини містять відповідно від 10 до 70 мкг білка;

- в кожну пробірку додають по 1,5 см3 розчину Бредфорда;

- через 5…10 хв. вимірюють оптичну густину при 595 нм, використовуючи як контроль пробу, що не містить білок;

В описаній методиці D595 лінійно залежить від кількості білка в інтервалі від 10 до 50 мкг.

10.4 Визначення білка за методом О. Лоурі

Суть методу

Визначення білка за Лоурі грунтується на його реакціїї зреактивом Фоліна, яка виявляє в білках тирозин та триптофан. Забарвлений білковий комплекс одержують в два етапи: 1) реакцією міді з білком в лужному середовищі; 2) відновлення фосфомолібденово-фосфовольфрамового реагента білком, що оброблений міддю.

Реакція білка з міддю закінчується за 5…10 хв. за кімнатної температури. Максимальне забарвлення спостерігається при рН 10…10,5. При більш високому рН забарвлення розвивається швидше, однак швидше й зникає. В автоматизованих системах спектрофотометрів, де час реакції точно контролюється, краще використовувати більш швидкий розвиток реакції при рН 11. Для цього треба підвищити концентрацію NaОН в реактиві В до 30…40%.

При роботі на СФ ручного режиму доцільно стабілізувати рН на рівні 10-ти, а при порівняльних дослідах точно витримувати час вимірювання та його умови. При додаванні реактиву Фоліна в суміш із затримкою на декілька секунд спостерігається слабке забарвлення.

Недоліком цього методу є те, що інтенсивність забарвлення різна у різних білків і не пропорційна концентрації білка в розчині.

Такі речовини як фенол, ПАСК (парааміносаліцилат натру), ТРИС (гідроксиметиламінометан), ЕДТА (етилендіамінтетраоцтова кислота) та деякі інші заважають визначенню білка за Лоурі. Фенол, ТРИС та ПАСК збільшують інтенсивність забарвлення, ЕДТА, навпаки, знижує його. Тому перед визначенням білка за Лоурі з розчину треба вилучити ці домішки діалізом, гельфільтрацією, додаванням надлишку іонів кальцію (якщо є ЕДТА). Ці домішки також треба враховувати при побудові калібрувального графіка, якщо в ньому виникає потреба при використанні фотоелектроколоримертів.

Застосування методу при роботі зі забарвленими тканинами потребує додаткової обробки матеріалу органічними розчинниками для вилучення пігментів.

Обробка листків, хлоропластів органічними розчинниками необхідна для вилучення пігментів та фенольних сполук, які забарвлюються реактивом Фоліна. Оскільки більша частина пігментів та ліпідів листків знаходиться в комплексі з білками, обробка органічними розчинниками може привести до втрати частини (іноді значної) білка ліпопротеїдної природи. Щоб запобігти цьому слід користуватися дуже охолодженими (до - 10°С) розчинниками. Крім того, необхідно запобігати підкисленню органічного розчинника тому що значно збільшується розчинність й ліпопротеїдів.

Гліцин (0,5) знижує на 50 % забарвлення, обумовлене білком. В зв'язку з цим при визначенні білка, що знаходиться в трис-гліциновому буфері, спочатку усувають гліцин шляхом осадження всього білка 10 % розчином трихлороцтової кислоти, центрифугують при 1000 об/хв., потім буфер зливають, а осад розчиняють в 0,5 М NaОН. Цей лужний розчин й беруть для визначення білка.

Фосфатні буфери в концентрації вище 0,1 М викликають появу осаду. Відомі також речовини (нижче вказана кінцева концентрація, %), що не мали впливу на інтенсивність забарвлення, а саме: сечовина 0,5, гуанідин 0,5, натрій вольфрамат 0,5, натрій сульфат 1,0, натрій нітрат 1,0, цинк сульфат 0,1, амоній сульфат 0,15, хлоридна кислота нейтралізована 0,5, трихлороцтова кислота нейтралізована 0,5, етиловий спирт 5,0, етер 5,0, ацетон 0,5, барій гідроксид 0,5.

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: піпетки на 1…2 см3 градуйовані, мірні циліндри на 100 см3, мірні колби на 1000 см3, круглодонна колба на 1500…2000 см3, пробірки на 3…10 см3, посуд для реактивів, центрифуга звичайна, центрифуга з охолодженням, холодильник Лібіха, холодильник кульковий, водяна баня.

Реактиви: ацетон, етиловий етер сульфатної кислоти (етилсульфат), трихлороцтова кислота (2% та 5 %), ортофосфорна кислота, хлоридна кислота, їдкий натр (0,5 н), натрій або калій гідротартрат, купрум сульфат, натрій вольфрамат, натрій молібдат, літій сульфат, бромна вода, кристалічний білок.

Реактив А (2 % розчин Na2CO3 у 0,1 н NaOH: 20 г Na2CO3 в 1000 см3 0,1 н розчину NaOH. Розчин готують в день проведення аналізу.

Реактив В (0,5 % розчин CuSO4•5H2O в 1 % розчині натрій або калій гідротартрату): 10 г Na2C4Н4О6 (К2C4Н4О6) розчиняють в 300 см3 дистильованої води. В цей розчин додають 5 г CuSO4•5H2O, після розчинення реактиву обєм суміші доводять до 1000 см3 дистильованою водою. Розчин виготовляють в день проведення аналізу.

Реактив С: перед визначенням готують суміш 50 см3 реактиву А змішують з 1 см3 реактиву В.

Реактив Фоліна – Чокальтеу: в круглодонну колбу на 1500…2000 см3 вносять 100 г натрій вольфрамату і 25 г натрій молібдату, розчиняють їх в 700 см3 дистильованої води.

До розчину додають 50 см3 85 %-ї фосфорної кислоти і 100 см3 концентрованої хлоридної кислоти. Колбу з'єднують із оберненим холодильником і суміш кип'ятять при слабкому нагріванні на сітці 10 годин. Після закінчення кип'ятіння в колбу додають 150 г літій сульфату, 5 см3 води та 5 крапель бромної води. Суміш кип'ятять без холодильника 15 хв. у витяжній шафі. Потім розчин охолоджують до кімнатної температури, доводять об'єм водою до 1000 см3 , фільтрують і зберігають в темній склянці з притертим шліфом. В одержаному реактиві визначають кислотність. Для цього реактив розводять в 10 разів і титрують 0,1 н NaOH по фенолфталеїну.

Реактив Е готують з реактиву Фоліна розведенням останнього дистильованою водою до 1 н розчину (за кислотою). Наприклад, при титруванні реактиву Фоліна його кислотність становила 2,3 н, то для виготовлення реактиву Е необхідно брати 10 см3 реактиву Фоліна і 13 см3 дистильованої води. Реактив Е зберігається тривалий час.

Підготовка матеріалу

- 100 см3 ліофільно висушеного або фіксованого іншим методом матеріалу заливають холодним ацетоном, суспензують;

- центрифугують з охолодженням 5 хв. при 3000 об/хв. Цю операцію повторюють 2…3 рази до повного виділення пігментів;

- осад промивають етилсульфатом і знову ацетоном,

- осад без пігментів настоюють при охолодженні 30 хв з 5 %-вою трихлороцетовою кислотою;

- центрифугують, потім осад промивають 2 % -вою трихлороцтовою кислотою;

- промитий осад розчиняють в 2 см3 0,5 н NaOH протягом 5 хв. на киплячій бані;

- центрифугують, осад вдруге промивають 5 см3 NaOH,

- в реакційну суміш беруть 0,1 см3 розчину (оптичну густину дослідного матеріалу визначають експериментально).

Хід аналіза

- до 0,1 см3 досліджуваного розчину додають 0,9 см3 дистильованої води, 5  см3 реактиву С,

- суміш ретельно перемішують і залишають при кімнатній температурі на 10 хв.;

- в кожну пробірку доливають 0,5 см3 реактиву Е і проби залишають при кімнатній температурі на 30 хв. для розвитку забарвлення;

- в присутності білка жовте забарвлення поступово змінюється на синє;

- інтенсивність забарвлення вимірюють на спектрофотометрі при 750 нм;

- концентрацію білка в пробі визначають за допомогою калібрувального графіка.

Побудова калібрувального графіка

- використовують кристалічний препарат чистого білка, найчастіше яєчний альбумін;

- 30 мг білка розчиняють в 100 см3 води;

- з цього розчину відбирають в серію пробірок  відповідно по 0,1, 0,3, 0,5, 0,7 та 0,9 см3 розчину білка;

- додають 5 см3 реактиву С, витримують 10 хв, потім 0,5 см3 реактиву Е;

- залишають розчин на 30 хв.;

- вимірюють його оптичну густину на спектрофотометрі при 750 нм.

Розрахунки

концентрацію білка Х (мг/г) в дослідному розчині обчислюють за формулою:

        10.3.JPG

де А – кількість білка в мг в 1 см3 дослідного розчину (визначають за калібрувальним графіком);

     V – об'єм, в якому розчинена наважка, см3;

     V1 – кількість вихідного розчину, що взятий для визначення, см3;

     P – наважка, г.

За кінцевий результат випробувань приймають середнє арифметичне результатів двох паралельних визначень, допустима абсолютна розбіжність між якими не повинна перевищувати 0,10%.

10.5 Визначення вмісту загального нітрогену 

Суть методу

Визначення вмісту нітрогену ґрунтується на руйнуванні органічної речовини сульфатною кислотою у присутності каталізатора. При цьому вивільняється нітроген у формі амоніаку, який сполучається із сульфатною кислотою й утворює амоній сульфатний. За додавання до останнього лугу виділяється амоніак, який відганяють і вловлюють титрованим розчином сульфатної кислоти, а надлишок кислоти відтитровують лугом.

За кількістю амоніаку визначають вміст нітрогену. Отриману кількість нітрогену помножують на відповідний коефіцієнт, обчислюють вміст білка (сирого протеїну).

У крохмалистих і цукристих видах рослин із високим вмістом води (картопля, капуста, цибуля, часник, кукурудза цукрова, горох мозковий, горох лущильний) вміст нітрогену рекомендовано визначати в сирій речовині.

Коефіцієнт перерахунку нітрогену на сирий білок для овочевих – 6,25.

Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: бюкси металеві, ложечка металева вузька; колби конічні круглодонні з корком К'єльдаля на 100…550, колби прийомні (конічні чи плоскодонні) на 250…300 см3; краплевловлювач (насадки К'єльдаля); холодильники кулькові; бюретки на 50 см3; мірні колби на 1000 см3; хімічні стакани на 500…1000 см3; мірні циліндри на 10, 25 і 50 см3; мензурки або мірні циліндри на 100 см3; лійки звичайні; фарфорова ступка, плитка електична, терези лабораторні, горілка газова лабораторна, сітка азбестова, фольга алюмінієва, папір фільтрувальний лабораторний, папір лакмусовий червоний.

         Реактиви: сульфатна кислота концентрована (густина 1,84 г/см3), яка не містить амоніаку; бурштинова кислота, хімічно чиста; селен металевий; купрум сульфат; калій сульфат; натронне вапно гранульоване.

Метиловий червоний: 0,02 г індикатора розчиняють у 100 см3 60 % (краще 96 %) етилового спирту.

Комбінований індикатор: змішують 100 см3 розчину метилового червоного (1 г метилового червоного розчиняють у 750 см3 96 % етилового спирту) і 50 см3 розчину метиленового синього (1 г метиленового синього розчиняють у 800 см3 96 % спирту). В кислому розчині індикатор дає червоно-фіолетове забарвлення, в лужному – зелене. В перехідній стадії, за рН 5,5 індикатор безбарвний. Його зберігають у темній склянці. Комбінованим індикатором зручно користуватися у випадку титрування за електричного освітлення.

Розчин сульфатної кислоти (0,1 н): 2,8 см3 хімічно чистої концентрованої кислоти (густиною 1,84 г/см3) беруть автоматичною піпеткою чи мірним циліндром, вливають у колбу місткістю 1000 см3 з налитою до половини дистильованою водою й доводять до мітки водою. Для приготування кількох літрів розчину сульфатної кислоти об’єм води відповідно збільшують. Розчин ретельно перемішують. Приготований розчин не буде точно 0,1 Н, але його титр визначати не потрібно.

Розчин їдкого натру (0,1 н): за масових аналізів готують 10…12 л розчину. Як правило, їдкий натр вкривається шаром карбонату натру, який утворюється від взаємодії з вуглекислотою повітря. Тому, готуючи розчин, беруть дещо більшу наважку, або за розрахунком (наприклад, замість 4 г на 1000 см3 беруть 4,5 г) і перед розчиненням швидко споліскують водою. Спочатку готують насичений розчин лугу, для цього обмиту водою наважку розчиняють у рівній за масою кількості води. Після охолодження розчин залишають на 3…4 тижні у склянці чи циліндрі, закритих гумовими корками, домішки карбонату натру при цьому випадають в осад. Розчин лугу обережно зливають, щоб його не збовтати, і розбавляють потрібною кількістю води для отримання 0,1 н розчину. Розчин їдкого натру змінює свій титр за поглинання вугільної кислоти з повітря, тому його ізолюють, ставлячи в бутель, сполучений із зовнішнім повітрям лише через трубку з натронним гранульованим вапном.

Розчинами лугу й кислоти можна користуватися тривалий час, але при цьому слід кожні два тижні перевіряти титр 0,1 н їдкого натру і встановлювати знову співвідношення між розчинами кислоти і лугу.

Визначення титру 0,1 н розчину їдкого натру: для встановлення титру краще користуватися бурштиновою кислотою С2Н4(СООН)2, яка не містить кристалізаційної води. Її легко отримати в чистому вигляді методом перекристалізації та сушіння за кімнатної температури. За наявності хімічно чистої бурштинової кислоти перекристалізацію можна не робити. Розчин бурштинової кислоти титрують за кип’ятіння у присутності індикатора фенолфталеїну, тому що ця кислота слабка.

Зважують на аналітичних терезах у скляні бюкси 3…4 наважки бурштинової кислоти по 0,1…0,2 г. Сушать наважки до постійної маси за температури 100°С, зважують бюкси з точністю до 0,01 г, а потім кожну з них висипають із бюкса в колбу для титрування й розчиняють у 20…25 см3 дистильованої води, а бюкси зі слідами бурштинової кислоти знову зважують. Різниця між результатами двох зважувань показує масу наважки. Приготовані розчини кип’ятять, додають 3…4 краплі фенолфталеїну й титрують розчином їдкого натру до появи не зникаючого протягом 50…60 с, рожевого забарвлення.

Приклад розрахунку. На титрування 0,1179 г бурштинової кислоти витрачено 21,35 см3 0,1 н розчину їдкого натру. З реакції взаємодії кислоти й лугу

НООС – (СН2)2 – СООН + 2NaOH = NaOOC – (CH2)2 – COONa + 2H2O

випливає, що одна молекула бурштинової кислоти еквівалентна двом молекулам їдкого натру. Тоді 118,09 : 80,01 = 0,1179 : 21,35, звідси титр 0,1 н розчину їдкого натру дорівнює:

             х10.JPG

 

Із 3–4 визначень беруть середнє.

Обчислення 0,1 н розчину їдкого натру за нітрогеном: 1 см3 точно 0,1 н розчину сульфатної кислоти відповідає 0,0014 нітрогену й еквівалентний 1  см3 точно 0,1 н розчину їдкого натру.

Звідси 1 см3 0,1 н розчину їдкого натру еквівалентний 0,0014 г (1,4 мг) нітрогену. Знаходимо, якій кількості нітрогену відповідає 1 см3 нашого 0,1 н розчину їдкого натру: 0,004 : 0,0014 = 0,003741 : Х, звідси:

             х101.JPG

Це й буде титром розчину 0,1 н їдкого натру, виражений за нітрогеном.

Розчин їдкого натру густиною 1,26–1,28 г/см3. 1 кг їдкого натру розчиняють у 3000 см3 дистильованої води, фільтрують крізь кілька шарів марлі та крізь скляну вату, охолоджують до кімнатної температури й перевіряють питому масу аерометром. За розчинення лугу відбувається сильне нагрівання, тому його спочатку розчиняють у фарфоровій ступці, безперервно обережно помішуючи товстою скляною паличкою.

Реактив Несслера. 17 г меркурій (ІІ) хлориду розчиняють у 300 см3 дистильованої води у хімічному стакані місткістю близько 0,5 см3; 35 г калій йодиду розчиняють у 100 см3 дистильованої води й переливають у склянку місткістю близько 1500 см3 з міткою 1000 см3. Далі повільно вливають перший розчин до другого, доки утворений при цьому червоний осад меркурій йодиду перестане розчинятися. Переливаючи 20 %-ий розчин їдкого натру, об’єм отриманого реактиву доводять до одного литра, додають розчин меркурій (ІІ) хлориду у склянку, доки знову з’явиться незникаючий осад.

Забарвлення відстояної рідини у склянці має бути світло-жовтим. Якщо вона безбарвна, додають ще розчин меркурій (ІІ) хлориду. Приготовлений реактив обережно зливають у склянку з темного скла і зберігають у темному місці. Чутливість реактиву до іону амонію після тривалого зберігання знижується.

Каталізатор. Каталізатором є суміш із калій сульфату, купрум сульфату та селену металічного, взятих у пропорції 100:10:2, яка підвищує температуру кипіння сульфатної кислоти і прискорює спалювання органічної речовини. Спочатку у ступці розтирають лише селен, потім туди ж додають купрум сульфат, потім калій сульфат, перемішують і просіюють крізь сито з отворами діаметром 0,5 мм. Не просіяну частину знову розтирають.

Вода для титрованого розчину лугу. Дистильована вода після її отримання містить велику кількість карбонатної кислоти, яка дуже повільно вивільняється. Для її швидкого вивільнення дистильовану воду кип’ятять у колбі протягом півгодини й охолоджують з щільно закритим корком, який має трубку з натронним вапном. Цей спосіб вивільнення карбонатної кислоти загальноприйнятий, але за масових аналізів краще застосовувати інший, спрощений спосіб, пропускаючи через дистильовану воду впродовж 10 годин потік повітря, очищеного кислотою та водою. У дистильованій воді, яка перебуває в рівновазі з повітрям, міститься така незначна кількість карбонатної кислоти, що нею можна знехтувати.

Прилад для пропускання струменя повітря збирають у такий спосіб. Бутель із водою закривають гумовим корком, крізь який пропущені довга (до дна) й коротка (яка сягає рівня води в бутлі) скляні трубки. Коротку трубку через запобіжну склянку приєднують до водоструменевого насосу, за допомогою якого повітря пропускають крізь воду. Повітря очищують, пропускаючи його попередньо через три промивні склянки: в першу наливають концентровану сульфатну кислоту, друга (пуста) є запобіжною, а у третій знаходиться дистильована вода. Останню склянку з’єднують із скляною трубкою, яка пропущена через корок бутеля до дна.

Хід аналіза

- cередні проби овочевих, узяті з подрібненої маси, подрібнюють у гомогенізаторі або розтирають у ступці до такого стану, щоб увесь матеріал проходив крізь сито з отворами діаметром 0,5 мм;

- зважують на технічних терезах у фарфорову чашку або бюкс з добре подрібненої проби по дві наважки від 3 до 10 г (залежно від умісту нітрогену в речовині);

- для капусти та картоплі можна брати 7 г;

- для страв з продуктів тваринного походження і з бобових - 0,5 – 1,0 г;

- для страв з продуктів рослинного походження, за винятком страв з бобових, - більше 1 г;

- для страв продуктів тваринного та рослинного походження - 1 г,

- наважки страв рідкої консистенції зважують на фользі у вигляді човника;

- наважку разом з фільтрувальної папером або фольгою, без втрат переносять у колбу К'єльдаля місткістю 100 см3 для спалювання, змиваючи залишки частинок невеликою кількістю води;

- для прискорення процесу спалювання і зменшення піноутворення рідини воду з колби попередньо випаровують, слідкуючи за тим, щоб речовина не обвуглилась (чим більше буде видалено води, тим менше буде утворюватися піна при спалюванні);

- до колби приливають концентровану сульфатну кислоту з розрахунку 12  см3 на 1 г сухої речовини;

- колбу К'єльдаля встановлюють на електричну плитку в похилому положенні під кутом близько 40 ° в витяжній шафі за допомогою штатива;

- для попередження піноутворення до колби додають 1 см3 етилового спирту;

- спалювання триває кілька годин, спочатку за слабкого нагрівання;

- коли виділення білих парів припиняється, додають 2 г каталізатора та підсилюють нагрівання колби;

- щоб уникнути викидання рідини колбу К'єльдаля закривають скляною грушоподібною конусоподібною пробкою,

- потім обережно проводять спалювання протягом 4-8 годин, в залежності від складу досліджуваного матеріалу;

- за піноутворення колбу знімають з вогню і злегка струшують для руйнування піни;

- для змивання часток органічної речовини, які прилипають до стінок колби, її час від часу повертають, перемішуючи вміст;

- спалювання закінчують після появи чистого зеленувато-блакитного забарвлення рідини, яке зникає після охолодження;

- якщо на горловині колби й на пробці залишився наліт органічної речовини, його змивають невеликою кількістю дистильованої води в охолоджену колбу і знову спалюють до появи вказаного вище забарвлення;

Відгін амоніаку:

- збирають установку для відгону амоніаку згідно з рисунком 33: плоскодонну колбу за допомогою гумової пробки з'єднують через краплеуловлювач з кінцем кулькового холодильника; холодильник33.JPG

закріплюють на штативі і підводять до нього дистильовану воду; у цю ж пробку вставляють скляну сполучну трубку, на яку надягають гумову трубку з затискачем; до нижнього кінця холодильника, за допомогою гумової трубки, приєднують скляний кінцевик. Кінцевик закупорюють у конічну колбу (приймач) місткістю 250 см3, в яку попередньо доливають 40 см3 розчину сульфатної кислоти молярної концентрацією 0,05 моль/дм3 (0,1 н), для уловлювання амоніаку. Кінцевик занурюють на 1,5…2 см у розчин сульфатної кислоти, перевіряють герметичність з'єднань. Критерієм підтвердження герметичності є відсутність утворення білих кристалів амоній сульфату (при негерметичності амоніак взаємодіє з сульфатною кислотою з утворенням білих кристалів);

- вміст колби К'єльдаля (мінералізат) охолоджують до температури 40 ° С,

- в колбу обережно доливають по стінці близько 50 см3 дистильованої води;

- рідину перемішують круговими рухами і переливають в плоскодонну колбу місткістю 500-1000 см3;

- колбу К'єльдаля кілька разів обполіскують дистильованою водою, яку зливають в ту ж плоскодонну колбу;

- всього на перенесення наважки використовують 150…200 см3 дистильованої води;

- у плоскодонну колбу, в яку поміщений розчин мінералізату, занурюють червоний лакмусовий папір;

- вливають розчин їдкого натру з масовою часткою 33% за допомогою лійки, з розрахунку 40 см3 на кожні 10 см3 сульфатної кислоти, взятої для спалювання наважки (додають розчин їдкого натру до синього кольору за лакмусом);

- далі установку для відгону амоніаку щільно приєднують до колби і ще раз перевіряють на герметичність;

- вміст плоскодонної колби перемішують круговими рухами;

- плоскодонну колбу закріплюють на штативі, поміщають під неї електричну плитку або газову горілку з азбестовою сіткою;

- вмикають воду і виконують відгін амоніаку при постійному кипінні вмісту колби;

- закінчення виділення амоніаку встановлюють по зникненню лужної реакції відігнаної рідини (відгону) за червоним лакмусовим папером;

- після відгону скляний кінцевик промивають дистильованою водою для того, щоб змити сульфатну кислоту;

- конічну колбу (приймач) знімають і вміст титрують розчином їдкого натру молярною концентрацією 0,1 моль/дм3 (0,1 н) у присутності 3…5 крапель розчину фенолфталеїну або змішаного індикатора. Титрування ведуть до переходу безбарвного розчину в слабо-рожевий (при використанні фенолфталеїну) або з фіолетового в зелений (при використанні змішаного індикатора);

- паралельно проводять контрольний дослід: у мірну склянку місткістю 100 см3 обережно наливають 40 см3 сульфатної кислоти молярною концентрацією 0,05 моль/дм3 і титрують розчином їдкого натру молярною концентрацією 0,1 моль/дм3

 

Розрахунки

Масову частку нітрогену Х,%, розраховують за формулою:

                10.5.JPG

де Кб - коефіцієнт перерахунку масової частки нітрогену, розрахованої за формулою (10.4) на масову частку білка, який для овочевих дорівнює 6,25, в стравах з використанням харчових продуктів тваринного походження – 6,25, в стравах з використанням продуктів рослинного походження – 5,7…6, в залежності від виду рослинної сировини (в зернових - 5,7; в бобових - 6).

За необхідності представлення результатів вимірювань білка в грамах на порцію страви (виробу) у числівнику формули (10.4) множник 100 замінюють на значення маси аналізованої порції страви (виробу) в грамах.

Приклад розрахунку:

У приймальну колбу взято 30 см3 точно 0,05 моль/дм3 розчину сульфатної кислоти. На титрування надлишку сульфатної кислоти пішло 21,56 см3 точно 0,1 моль/дм3 розчину їдкого натру. Наважка другої страви, взята для аналізу, становить 0,5 г. Маса страви – 250 г.

Кількість нітрогену в страві, г:

        х102.JPG

Кількість білка в страві, яка виготовлена з використанням продуктів тваринного походження: 6,75•6,25 = 42,18 г.